depanare western blot

Rezolvați problemele western blot cu aceste sfaturi de depanare, care acoperă cauzele obișnuite de lipsă de semnal, fundal ridicat, benzi multiple și multe altele.

1. Fără semnal
2. Fundal ridicat.
3. Mai multe benzi.
4. „Pete” albe neuniforme pe pete.
5. Puncte negre pe pete.
6. Benzi albe pe o pată neagră.
7. Banda de marcare a greutății moleculare este neagră.

1. De ce nu funcționează Western blot?
2. De ce este pata mea Western blot?
3. Te speli după blocarea Western blot?
4. Ce cauzează legarea nespecifică în Western blot?
5. Cum îmi pot îmbunătăți rezultatele western blot?
6. De ce folosim lapte în Western blot?
7. Care sunt etapele Western Blot?
8. Poți să transferi peste Western Blot?
9. Cum confirmați transferul benzilor de proteine ​​de la gel la membrană în protocolul Western Blot?
10. Cât timp puteți bloca un Western blot?
11. Poți bloca o Western Blot în weekend?
12. De câte ori poți să dezbraci o Western blot?

De ce nu funcționează Western blot?

Dacă aveți prea puține proteine, dacă anticorpul dvs. primar nu are o afinitate ridicată sau dacă anticorpul dvs. primar este la o diluție sub-optimă, nu vă veți vedea proteina. Alternativ, dacă încărcați prea multe proteine, raportul semnal / zgomot poate crește, provocând dificultăți în vizualizare.

De ce este pata mea Western blot?

Care este motivul unui frotiu într-un western blot? După cum puteți vedea din colorarea ponceau a transferului, există un frotiu care merge pe toate primele 7 benzi. Probele sunt celule stem embrionare lizate prin tampon de probă 2xLSB, pipetare și fierbere. ... Aparent, frotiul se datorează prea multor celule dintr-o fântână.

Te speli după blocarea Western blot?

Blocarea este un pas foarte important în faza de imunodetecție a Western blotting, deoarece împiedică legarea nespecifică a anticorpului de membrana blotting. După blocare, pata este clătită în tampon de spălare, de obicei TBST, cu agitație ușoară și în volum suficient pentru a menține pata scufundată. ...

Ce cauzează legarea nespecifică în Western blot?

Una dintre cele mai frecvente cauze ale benzilor nespecifice este blocarea incompletă. Tampoanele de blocare sunt utilizate pentru a preveni legarea anticorpilor primari și secundari de membrană sau de orice altceva decât proteina de interes.

Cum îmi pot îmbunătăți rezultatele western blot?

Soluţie

1. Reduceți concentrația primară de anticorpi.
2. Reduceți cantitatea de proteine ​​totale încărcate pe gel.
3. Reglați condițiile de blocare a membranei.
4. Creșteți numărul de spălări.
5. Verificați specificitatea anticorpului.
6. Ștergeți numai cu anticorpul secundar.
7. Dacă se dezvoltă benzi, alegeți un anticorp secundar alternativ.

De ce folosim lapte în Western blot?

Blocarea este un pas foarte important al Western blot, deoarece previne legarea anticorpilor de membrană nespecific. Blocarea se face adesea cu 5% BSA sau lapte uscat fără grăsime diluat în TBST pentru a reduce fundalul. ... Anticorpul poate fi diluat într-un tampon de spălare, cum ar fi PBS sau TBST.

Care sunt etapele Western Blot?

Cinci pași sunt implicați în procedura Western Blotting și testul de detectare, și anume, transferul, blocarea, incubația primară a anticorpilor, incubarea secundară a anticorpilor și detectarea proteinelor și analiza Western Blot.

Poți să transferi peste Western Blot?

Cu creșterea timpului, există totuși un risc de supra-transfer (dezlipire, suflare) a proteinelor prin membrană, în special pentru greutatea moleculară mai mică (<30 kDa) proteine ​​atunci când se utilizează membrane cu o dimensiune mai mare a porilor (0,45 µm). Fluxul de lucru al electrotransferului umed / rezervor de proteine ​​pentru Western Blot.

Cum confirmați transferul benzilor de proteine ​​de la gel la membrană în protocolul Western Blot?

Protocol de transfer al proteinelor

1. Pregătiți membrana PVDF umezind-o în metanol timp de 30 de secunde și apoi înmuiând-o scurt în apă distilată urmată de tampon de transfer 1X. ...
2. Înmuiați hârtia filtrantă și bureții în tamponul de transfer timp de 10 minute înainte de asamblarea sandvișului de transfer.

Cât timp puteți bloca un Western blot?

În general, timpul maxim de blocare nu trebuie să depășească 2 ore la temperatura camerei sau proteinele pot fi schimbate din membrană. Diluați anticorpul primar până la concentrația / diluarea recomandată în soluție proaspătă de blocare (TBS și / sau PBS (comprimate PBS 524650-1EA) / lapte uscat 3% degresat).

Poți bloca o Western Blot în weekend?

Anticorpii cu titru puternic funcționează cel mai bine la o incubație scurtă și anticorpii slabi ai anvelopelor necesită o incubație mai lungă (la concentrație mai mare). Lăsarea petei în tamponul de blocare peste noapte sau în weekend la 4C nu dăunează.

De câte ori poți să dezbraci o Western blot?

de asemenea, în timp ce încercăm să îndepărtăm anticorpii primari, este important să observăm că există probabilitatea ca puteți pierde o parte din proteinele pe care le-ați atașat sau transferat pe membrană, de aceea este recomandabil să nu dezbrăcați membrana de mai multe ori.